Zlecenie 8934261 - Innowacyjna terapia komórkowa glejaka Produkcja i...

nakowanego (tag-free) w bakteryjnych systemach ekspresyjnych do celów badań naukowych. Produkcja rekombinowanego białka obejmuje następujące etapy: 1. Synteza genów i optymalizacja kodonu w genie (Sekwencja białka zostanie dostarczona przez Zamawiającego – długość sekwencji 182 ± 10 aminokwasów), 2. Klonowanie bezpośrednie w wektorach plazmidowych, 3. Ocena ekspresji białek w małej skali w szczepie E.coli (minimalnie 2 – 3 warunki ekspresji), 4. Weryfikacja ekspresji białek za pomocą elektroforezy w warunkach denaturujących (SDS-PAGE), 5. 10 l hodowla wysokiej gęstości komórek w systemie E.coli, 6. Kontrola jakości. Wykonawca zobowiązuje się przesłać: a) plazmid po klonowaniu, b) raport z oceny ekspresji białek w małej skali, c) raport końcowy i certyfikat analizy zawierający m.in. - specyfikacje czystości, - badanie sterylności, - poziom endotoksyn, - oświadczenie o stabilności. II) Oczyszczanie białka z pasty bakteryjnej otrzymanej po hodowli wysokiej gęstości w systemie E.coli. Oczyszczanie białka obejmuje następujące etapy: 1. Oczyszczanie na dużą skalę: a. Liza komórek w homogenizatorze, b. Etapowe oczyszczanie supernatantu poprzez stopniowe wytrącanie w obecności siarczanu amonu, dializę, ogrzewanie i końcowe wytrącanie w siarczanie amonu - kontrole SDS-PAGE, c. Końcowe oczyszczanie za pomocą chromatografii SEC (size exclusion chromatography,) lub IEX (Ion Exchange Chromatography), d. Wykonanie kontroli jakości produktu końcowego za pomocą m.in. spektroskopii UV-Vis lub Bradford assay oraz SDS-PAGE, e. Wykonanie raportu z oczyszczenia na dużą skalę. Wykonawca zobowiązuje się dostarczyć: I. Zatężony oraz przefiltrowany 0.22 um produkt końcowy w możliwie najkrótszym czasie po oczyszczeniu, utrzymując produkt w formie zamrożonej, w stężeniu minimalnie 10 mg/ml w porcjach po 50 ml. II. Raport z oczyszczania na dużą skalę, III. Dokładny, powtarzalny protokół oczyszczania (metodologia). Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego białka będzie realizowane w ramach trzech (3) procesów zamawianych sukcesywnie, każdy proces będzie obejmował 10 l hodowlę (z uzyskaniem min. 2g białka). Wymagana ilość białka po oczyszczeniu z pasty bakteryjnej uzyskanej z 10 l hodowli (ok. 600 g pasty): min. 2g. Wymagany poziom endotoksyn po oczyszczeniu białka: < 0.01 EU/ug białka.